免疫分析
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Western-bloting技術服務 酶聯免疫反應 免疫組化技術服務
Western-bloting技術服務
一、Western-bloting技術原理
  免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting),它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析。
二、Western-bloting技術流程

1.         蛋白質抽提 
a. 
實驗對象為組織樣品,取適量(250~500mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑),勻漿后抽提總蛋白(或核蛋白)。 
b. 
實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×1061×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑)抽提總蛋白(或核蛋白)。

2.         蛋白質定量按蛋白質定量試劑盒操作說明操作,測定樣品濃度。

3.         變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE) 將準備好的樣品液和生物素標記的蛋白質分子量標準分別上樣,標準加進第一個孔中,電泳分離蛋白。

4.         蛋白質轉移到硝酸纖維膜或PVDF Bio-Rad蛋白轉移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層,30mA恒流條件下,4°C轉移過夜。

5.         膜的封閉和抗體孵育 
 a. 
膜在5BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。 
 b. 
封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時,抗原抗體結合。 
 c. 
加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準,室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。

6.         結果檢測化學發光法檢測,膜與化學發光底物孵育,經X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件,并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。

7.         數據分析 目的蛋白的灰度值除以內參GAPDH的灰度值以校正誤差,所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8.         提供實驗報告包括詳細的實驗方法及免疫印跡實驗結果的相關圖表。

三、WB樣本準備  
  組織樣品(新鮮或是正確保存的組織)250-500mg;細胞樣本≥1×106個細胞數。此外客戶需提供有效的一抗或代購??突杼峁┘觳餑康牡鞍椎南晗副塵白柿?,以及樣本的種屬,類型。
 
酶聯免疫反應
一、ELISA原理
  ELISA是以免疫學反應為基礎,將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應物,從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中,通過不同的設計,具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA競爭法。
二、ELISA實驗操作    

1.         取出試劑盒,于室溫(20-25)放置15-30分鐘。實驗過程應在室溫(20-25)進行。

2.         取出酶標板,按照標準品的次序分別加入50 μl的標準品溶液于空白微孔中。

3.         空白微孔中加入50 μl的樣品,空白對照加入100μl的蒸餾水。

4.         在各孔中加入100μl的酶標記溶液(不含空白對照孔)。

5.         將酶標板用封口膠密封后,37孵育反應 1小時(在孵育箱中保持穩定的溫度與濕度)。

6.         充分清洗酶標板5次,保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1100的比例與蒸餾水稀釋

7.         酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干。

8.         各孔加入顯色劑A 50 μl。

9.         各孔加入顯色劑B 50 μl。

10.     20-25下避光反應15分鐘。

11.     各孔加入50μl終止液,終止反應。

三、ELISA樣本準備
  在收集標本前都必須有一個完整的計劃,必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。我們提倡新鮮標本盡早檢測,對收集后當天就進行檢測的標本,及時儲存在4℃備用,如有特殊原因需要周期收集標本,請造模取材后,將標本及時分裝后放在-20℃或-80℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差,蛋白極易降解,直接影響實驗質量,所以避免反復凍融??突〔那靶胂蛭宜鞠廴嗽彼饕得魘?,具體操作注意事項請與我司技術人員溝通。
◇液體類標本:
  包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清等。
  *血清:
室溫血液自然凝固1個小時后,離心10分鐘左右(3000-5000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
  *血漿:
應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心10分鐘左右(3000-5000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
        *尿液:
用無菌管收集。離心10分鐘左右(3000-5000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
        *細胞培養上清:
檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心10分鐘左右(3000-5000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心10分鐘左右(3000-5000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
        *組織標本:
切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心10分鐘左右(3000-5000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
 
免疫組化技術服務
一、免疫組化原理
  根據抗原抗體反應和化學顯色原理,組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合,再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應,前者再用標記辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如鏈霉親和素等)結合,最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分,在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物,從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。
二、免疫組化實驗操作 

   1.         60烤片2小時

   2.         脫蠟。二甲苯脫蠟15分鐘,三次

   3.         水化。依次經過無水乙醇、95%、90%、80%、70%,各5分鐘,蒸餾水(或自來水)5分鐘

   4.         PBS5分鐘,三次

   5.         抗原修復。枸櫞酸緩沖液(約92-95)煮沸(沸水?。┬薷?/span>15分鐘,自然涼至室溫。PBS5分鐘,三次

   6.         3%雙氧水封閉20分鐘,PBS5分鐘,三次

   7.         正常山羊血清封閉,3720分鐘

   8.         一抗孵育,4過夜.

   9.         復溫20分鐘,PBS5分鐘,三次

   10.     二抗孵育,3720分鐘(二抗為生物素標記的羊抗兔IgG),PBS5分鐘,三次

   11.     三抗孵育,3720分鐘(三抗為辣根酶標記的鏈酶親和素),PBS5分鐘,三次

   12.     DAB顯色,鏡下觀察結果,適時終止

   13.     蘇木素復染5分鐘,自來水沖洗片刻,75%的鹽酸酒精溶液分化30秒,自來水沖洗5分鐘藍化

   14.     脫水。依次經過70%、80%、90%、95%、無水乙醇,各5分鐘,二甲苯15分鐘,三次

   15.     封片,中性樹膠封片

三、免疫組化樣本準備
  組織切片或組織蠟塊
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